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    細胞凍存有哪些注意事項?

    關鍵詞:細胞實驗外包  細胞培養  實驗室  細胞培養  干細胞 細胞檢測 第三方檢測機構
     
    細胞培養的傳代及日常維持過程中,在培養器具、培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費,而且細胞一旦離開活體開始原代培養,它的各種生物特性都將逐漸發生變化并隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細胞儲存在液氮中,溫度達-196℃,理論上儲存時間是無限的。


    細胞凍存的步驟:
    配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛血清的凍存培養液;
    取對數生長期的細胞,去除舊培養液,用 PBS 清洗。
    去除 PBS,加入適量胰蛋白酶 (覆蓋培養皿表面) 把單層生長的細胞消化下來;
    離心 1000rpm,5min;
    去除胰蛋白酶,加入適量配制好的凍存培養液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數,調節凍存液中細胞的最終密度為 5×106/ml~1×107/ml;
    將細胞分裝入凍存管中,每管 1~1.5 ml;
    在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;
    凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱 2h ,然后放入-70℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內。


    關于細胞凍存的注意事項:
    1.  為保持細胞最大存活率,一般都采用慢凍存融的方法。
    2.  凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為-1℃~12℃/ 分鐘,當溫度下降達-25℃時,下降速度可增至-5~-10℃/ 分鐘,到-100℃時則可迅速凍入液氮中。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度,過快能影響細胞內水分透出,太慢則促冰晶形成。
    3.  初次凍存者在下降凍存時,宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置,然后需用溫度計與凍存物并行的辦法,以觀測下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關系,當已掌握以上各參數和凍存技術熟練后,僅按下降時間和下降距離便可獲理想凍存效果。
    4.  各種細胞對凍存速度的要求也不一樣;上皮細胞和成纖維細胞耐受性可能大些,骨髓干細胞-2~-3℃/ 分鐘合適;胚胎細胞耐受性較小,不宜太快??傊谝婚_始時,下降速度不能超過-10℃/ 分鐘。
    5.  用什么防護劑合適和用量多大,要依細胞而定,初代培養細胞用 DMSO 較好,一般細胞可用甘油;用量以較小為好。有人認為人皮膚上皮細胞貯存在 20%-30% 甘油中很好。
    6.  原則上細胞在液氮中可貯存多年,但為妥善起見,凍存一年后,應再復蘇培養一次,然后再繼續凍存。
    7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護工作,以免凍傷
    8. 注意自身的安全,對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過程中,應避免引起氣溶膠的產生,小心有毒性試劑例如 DMSO,并避免尖銳物品傷人等。



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