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    常見問題解答

    關于引物的常見問題匯總
     
    關鍵詞: pcr  基因檢測  檢測  pcr實驗室  pcr技術  熒光定量pcr  第三方檢測中心  分子生物學 引物

    1. 引物是如何合成的?
     
    目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產,而Bioneer自行研制的專利384并行高通量DNA合成儀,可實現99%的高合成率。無論采用什么機器合成,合成的原理都相同,主要差別在于合成產率的高低,試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。
    亞磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。
    第一步是將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應,脫去其5′-羥基的保護基團DMT,獲得游離的5′-羥基。
    第二步,合成DNA的原料,亞磷酰胺保護核苷酸單體,與活化劑四氮唑混合,得到核苷亞磷酸活化中間體,它的3′端被活化,5′-羥基仍然被DMT保護,與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應。
    第三步,帶帽(capping)反應,縮合反應中可能有極少數5′-羥基沒有參加反應(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應,這種短片段可以在純化時分離掉。
    第四步,在氧化劑碘的作用下,亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。
    經過以上四個步驟,一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT,重復以上步驟,直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
    通過氨水高溫處理,連接在CPG上的引物被切下來,通過OPC, PAGE等手段純化引物,成品引物用C18濃縮、脫鹽,沉淀。沉淀后的引物用水懸浮,測定OD260定量,根據定單要求分裝。

    2.引物純化方式有哪些,如何選擇?
    ◆ 脫鹽
    寡核苷酸合成后,為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結構,首先必須去除保護基團。通過濃氨水處理,合成的寡核苷酸從固相載體上分離,2-氰乙氧基--磷酸二脂鍵的保護基團,以及堿基的保護基團基(苯甲?;彤惗』┍蝗コ?,從而形成了天然的DNA結構。然而,必要的去保護步驟完成后,寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機化合物。所有非必須有機化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機雜質,但它不能有效移除合成中產生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而,脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足PCR檢測等基礎生物研究。
    ◆ BioRP / OPC純化
    如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成,則N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基團,提前終止的寡核苷酸不包含該基團。因為DMT基有強的親脂的特性,有5’-DMT基團的寡核苷酸與反相樹脂有親和性,因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和5’-DMT寡核苷酸存在強親和力,但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團,所以,我們能夠成功的把想要的N-甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質中分離出來。
    ◆ HPLC
    如果合成的寡核苷酸應用于克隆,定向誘變或定量的基因探測,那么對其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達不到要求,則HPLC純化被廣泛地用于這個目的。作為一種純化樹脂,陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率,對于達到35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹脂化的HPLC與陰離子交換樹脂的HPLC呈現相似的純化效率。因為HPLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長度,用HPLC法不能有效純化長的寡核苷酸(大于35-mer)。
    ◆ PAGE
    對于長的寡核苷酸的純化(50-100mer),我們推薦PAGE純化法,它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠(電泳)作為純化基質。盡管PAGE顯示出高的純化效率(>98%),但它在額外的步驟方面有一些缺陷,比如在PAGE之后需要提取和脫鹽,繼而將導致純化產率的下降。

    3.引物的OD數如何定量?
    答:引物合成引物OD數是這樣測定的:用紫外分光光度計,波長260nm,石英比色杯,光程為1厘米,測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后,用1ml水稀釋測OD值。需要根據稀釋倍數換算出母液的OD值。

    4.需要什么級別的引物?
    答:引物常用的純化方式脫鹽、BioRP / OPC純化、PAGE純化、HPLC純化。根據實驗需要,確定訂購引物的純度級別。

    應用 引物長度要求 純度級別要求
    一般PCR擴增 <45 base BioRP / OPC
    一般PCR擴增 >45 base PAGE
    診斷PCR擴增 < 40base BioRP / OPC, PAGE
    DNA測序 20base左右 BioRP / OPC
    亞克隆,點突變等 根據實驗要求定 BioRP / OPC, PAGE,HPLC
    基因構建(全基因合成) 根據實驗要求定 PAGE
    反義核酸 根據實驗要求定 PAGE
    修飾引物 根據實驗要求定 PAGE, HPLC

    5.最長可以合成多長的引物?
    答:引物越長,出現問題的概率就越大。有的公司合成過120base的引物,產率很低。除非需要,建議合成片段長度不要超過80mer,按照目前的引物合成效率,80mer的粗產品,全長(還不一定正確)引物的百分比不會超過40%,后續處理還有丟失很多,最后的產量很低。

    6.需要合成多少OD數?
    答:根據實驗目的確定。一般PCR擴增,2 OD引物,可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接,1 OD就足夠了。但是有些研究人員,就做幾次PCR,但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長,但是我們有些研究人員也要求高OD數。片段越長, 最后全長得率就越低,出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數要求,其實也是對社會資源的一種浪費,同時也從一個側面反映了部分研究人員特別是新手的自信心不足,總覺得需要重復多次才能成功。

    7.如何檢測引物的純度?
    答:實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和,上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,容易加樣。600V電壓進行電泳,一定時間后(約2-3小時),剝膠,用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型,在主帶之下沒有雜帶,說明純度是好的。如果條件許可,也可以用EB 染色或銀染方式染色。
    而有的廠家提供Maldi-TOF質譜QC質量控制,從而保障了合成的準確率:
    Bioneer使用多重Maldi-TOF質譜儀進行全自動裝載及監測。 每份樣品的質譜分析數據將自動插入到寡核苷酸的信息單中。Bioneer是世界上僅有的幾個對生產的每份核苷酸 (單個寡核苷酸和高通量和成) 都用MALDI-TOF質譜儀檢測進行核苷酸QC檢測的廠商,而且免費提供質譜數據。

    8.如何計算引物的濃度?
    答:引物保存在高濃度的狀況下比較穩定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情況下,建議將引物的濃度配制成50pmol/ul,加水的體積(微升)按下列方式計算:V (微升)= OD數*(乘)33 *(乘)*(乘)20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配制成其他濃度,按上述公式換算。
    注意:1 OD260= 33 ug/ml.

    9.如何計算引物的Tm值?
    答:引物設計軟件都可以給出Tm,與引物長度、堿基組成、引物使用緩沖的離子強度有關。
    長度為25mer以下的引物,Tm計算公式為:
    Tm =            4℃   (G + C)+ 2℃   (A + T)
    對于更長的寡聚核苷酸,Tm計算公式為:
    Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size
    公式中,Size = 引物長度。
    Tm的定義:Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.

    10.引物(含修飾)的分子量是如何確定的?
    答:非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報告單上都有明確的標示。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5,引物的分子量=堿基數 x 堿基的平均分子量?;虬聪铝泄接嬎鉓W= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) +(Nx * Wx)+( Ni* Wi) +16* Ns- 62.
    NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數量,WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod 分別為修飾基團的數目和分子量。
    對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數,例如G+A混合的分子量為(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns為硫代數目,硫代每個位置增加分子量16。
    常規堿基分子量:

    Base Molecular Weight
    A 313.21
    C 289.18
    G 329.21
    T 304.19
    I 314.2
    U 290.17
    常規修飾基團分子量
    修飾基團 分子量   修飾基團 分子量
    5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60
    5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49
    5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46
    5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07
    5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18
    5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12

    11.如何溶解引物?
    答:干燥后的引物質地非常疏松,開蓋前最好離心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tris pH7.5緩沖液,室溫放置幾分鐘,振蕩助溶,離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5),引物在這種條件下不穩定。

    12.如何保存引物?
    答:引物合成后,經過一系列處理和純化步驟,旋轉干燥而成片狀物質。引物在溶解前,室溫狀態下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重復性要求較高,合成的OD數較大,建議分裝,避免反復凍融。修飾熒光引物需要避光保存。

    13.合成的引物5'端是否有磷酸化
    答:合成的引物5'為羥基,沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5′端磷酸化,或者要求引物合成公司合成時直接在5′或3′端進行磷酸化,需要另外收費。

    14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題?
    連接反應需要引物的5’磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上,引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上,需要檢查載體的酶切效果,需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結構,退火的難度較大,退火時需要提高退火溫度。

    15.測序發現引物有突變是怎么回事?
    答:測序發現引物區域有突變,特別是40個堿基以下的引物, 發生的概率不大,但是肯定也會發生。用戶一般可以放心,引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的,堿基輸錯的機會不多。核酸合成公司一般會有一套控制辦法,預防堿基輸入錯誤。發生這種突變的原因有很多解釋,人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣,采用的機器也基本相同,合成主要原料都是由可數的幾家跨國公司提供的,所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似,沒有人可以超脫。
    引物合成是一種多步驟的化學反應,合成效率最高也就是99%,副產品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復,一般認為,偶連過程中,正在偶連的部分單體發生丟失DMT,導致單體又接了上去,故發生插入同一堿基的突變。至于缺失突變,一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不徹底造成的,Caping反應主要是封閉極少數5′-羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物,在下一輪偶連時將不能繼續參與合成。對于堿基置換的突變,產生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護,即引物上可能含有殘留保護基團,引物的這些區域不能很好地與互補鏈配對,當擴增的產品被亞克隆轉化到大腸桿菌中,可能被細菌中修復系統補上了非配對的堿基。置換突變通常發生在G 轉換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉化為烯醇異構體 (脫嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA復制和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A,測序就會發現堿基G-A置換。脫嘌呤現象在富含嘌呤的引物中發生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解,測序就會發現堿基G或A的缺失。
    引物合成過程中,造成堿基插入,缺失,置換突變的因素客觀存在,有不少降低發生的頻率建議和措施,但是這些措施還停留在實驗室階段,還沒有能夠應用到規?;a中。

    16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高?
    答:引物合成時,每一步反應效率都不能達到100%,產生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長,突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失,這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增,不可能絕對保證擴增產物中沒有突變,引物合成也不可能保證100%正確。要知道,引物合成中發生錯誤(非人為因素)的頻率,比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。做引物合成,長鏈引物合成,您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

    17.如果測序發現突變,該如何處理?
    答:遇到這種情況,首先和核酸合成廠家取得聯系,生產人員會檢查生產的原始記錄,主要是核對合成序列是否和定單一致,他們在電腦中一般會保留所有原始數據。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下,建議重新挑取克隆測序,可能會找到正確克隆的。根據經驗,40個堿基以下的引物,測1-2個克隆就可以了;40個以上的特別是用于全片段拼接合成的,就需要多測一些了。一般情況下,每個克隆突變的位點都不一樣,提示正確的總是有的,就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次,不過重合的引物和第一次的引物一樣,都可能含突變,不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率?;蚱唇舆^程中,如果發現一段區域突變點不多,就多測幾個,否則就重合一下引物。

    18.引物是經過PAGE純化的,為什么還有堿基缺失或插入?
    答:理論上分析型PAGE變性電泳,可以區分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳,上樣量都是非常大,電泳時的條帶非常寬,帶與帶之間有重疊,分辨率已下降,電泳后割帶回收目的引物時,很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內有一個不好的現象,PAGE純化的引物,特別是長引物要的量都比較高,導致割的條帶有時可能比較寬。建議:您如果減少OD數,引物遇到的問題可能就會少一些。

    19. TaqMan 探針設計的基本原則是什么?
    答:下列原則供您參考。
    ◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物(擴增產物50-150bp),但不能與引物重疊。
    ◆長度一般為18-40mer 。
    ◆G-C含量控制在40-80%左右。
    ◆避免連續相同堿基的出現,特別是要避免GGGG或更多G出現。
    ◆在引物的5'端避免使用G。
    ◆選用比較多的堿基C。
    ◆退火溫度Tm控制在 68-70C   左右。
    有用的熒光染料參數

    Name 吸收波長 發射波長 colors
    6-FAM (6-carboxy-fluorescein) 494nm 518nm Green
    TET  (5-tetrachloro-fluorescein) 521nm 538nm Orange
    HEX (5-hexachloro-fluorescein) 535nm 553nm Pink
    TAMRA(tetramethyl-6-carboxyrhodamine) 560nm 582nm Rose
    ROX (6-carboxy-x-rhodamine) 587nm 607nm Red
    Cy3  (Indodicarbocyanine) 552nm 570nm Red
    Cy5(Indodicarbocyanine) 643nm 667nm Violet

    20.Primer設計的基本原則是什么?
    答:引物設計的下列原則供您參考。
    ◆引物長度一般在18-35mer。
    ◆G-C含量控制在40-60%左右。
    ◆避免近3'端有酶切位點或發夾結構。
    ◆如果可能避免在3'端最后5個堿基有2個以上的G或C。
    ◆如果可能避免在3'端最后1個堿基為A。
    ◆避免連續相同堿基的出現,特別是要避免GGGG或更多G出現。
    ◆退火溫度Tm控制在 58-60C 左右。
    ◆如果是設計點突變引物,突變點應盡可能在引物的中間。

    21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ?
    答:引物應該全是DNA,但是OD260/OD280的比值為什么那么低,怎么會有蛋白質污染?引物化學合成,哪里有機會污染到蛋白質?需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關。
    A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

    Base Composition A260/280
    5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50
    5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85
    5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15
    5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14
    5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66

    22.同樣的OD用PAGE檢測,EB染色為什么深淺不一?
    答:通??梢杂肊B染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質粒DNA),因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA,由于堿基組成不同,形成二級結構的可能性不同,EB的染色程度也會有差異,比如Oligo(dT)等不形成二級結構,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量,而用紫外分光光度計檢測。同樣道理,用EB染色來照片不適合所有引物。

    23.引物不純會有什么后果?
    答:引物不純可能會導致:1)非特異性擴增;2)無法用預先設計在引物5′端酶切位點的酶切開,特別是沒有保護堿基的引物;3) 用于測序出現雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。

    24.已經溶解的引物,為什么原先使用正常,而過一段時間再使用就不好了?
    答:如果溶解引物的水PH過低或污染了菌或核酸酶,會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合,液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物,避免反復凍溶。建議使用10mMT ris pH7.5緩沖液溶解引物,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5), 引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒有問題,而是PCR使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。

    25.PCR擴增不出就引物有問題嗎?
    答:基本不是。當今發展出各色各樣的PCR擴增技術,各色各樣的高溫聚合酶,就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出、擴增效率低的問題。如巢式PCR就是擴增那些拷貝數很低的基因片段。 有些重復片段的擴增, GC含量高的片段,非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。
    引物擴增不出,主要是下列兩種情況比較常見:
    (1) RT-PCR。請注意,很多基因通過常規RT -PCR方法是很難擴增出來的。 RT- PCR成功的關鍵在于RT的反應的RNA質量和目標基因在特定組織和細胞中含量。
    (2)從基因組中擴增。一般情況下,基因在基因組中都是單拷貝,基因組作為模板需要嚴格控制用量?;蚪MDNA過高,會影響反應體系中的Mg和pH
     
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