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    透射電鏡樣本制備方法和要求


    透射電鏡樣本制備.jpg


    1. 生物樣品負染:滴在銅網上的樣品溶液經1-2%的磷鎢酸(PTA,pH6.5-7.0)染色5-10s后干燥,在透射電鏡中觀察。


    2. 生物樣品超薄切片制備流程:材料樣品的超薄切片制備參見步驟2.42.5。

     

    樣品取材要求:

     

    1)新鮮。(材料離體后1-5min內進入固定液,避免細胞自溶和結構變化)

     

    2)體積小。(厚度< 1mm,長度寬度均< 5mm,固定液滲透能力有限,組織太大會導致無法固定充分)

     

    3)機械損傷小。(動作輕巧,器械鋒利,避免對阻止的擠壓和推拉,建議用剃須刀片、手術刀片、手術剪刀。)

     

    4)低溫操作,器械、容器、固定液均需預冷。(降低酶的活性,減少組織自溶)

     

    5)取材部位準確,且注意材料的方向性和定位。

     

    2.1取樣&固定:

     

    2.1.1取樣及戊二醛固定

     

    戊二醛(多為2.5%),超純水配成6-10%的水溶液,使用前加0.2M磷酸鈉緩沖液稀釋至所需濃度(有細胞壁的樣品5%,無細胞壁樣品3%,磷酸緩沖液終濃度0.1M,PH7.2),現配現用??筛鶕悠愤x擇其他緩沖體系。

     

    切取一小塊組織,置入預冷的戊二醛固定液(3-5%)中,4℃預固定20分鐘后,撈出置于潔凈的保鮮膜或培養皿上(已滴有預冷的固定液),在固定液中用將組織切成2-5mm長, 2-3mm寬, 1mm厚的細條,移入盛有預冷的戊二醛固定液的2ml離心管中,4℃固定過夜。

     

    1)植物細胞的細胞壁和液泡會阻礙固定液迅速滲入。植物材料內部存有的空氣,往往使材料漂浮于固定液面之上,由此影響到植物組織的固定效果。組織放入戊二醛固定液后,可用真空泵抽出組織內部的氣體,使材料沉入固定液中。

     

    2)動物樣本的取材,可將動物麻醉或急性處死后切取組織?;蛘卟捎迷还潭?、流灌固定后再切取所需組織。

     

    3)細胞培養的樣品,輕微并短暫離心,倒凈培養液后,加入預冷的固定液,4℃固定10min后,低溫6000rpm/min離心5min(離心力不可過大,離心時間不可過長,避免機械擠壓,使用1.5ml離心管方便收集細胞),去上清,滴加新鮮固定液并重懸,4℃固定過夜。

     

    漂洗

     

    2.1.2鋨酸固定

     

    倒掉固定液,用0.1M,pH7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次,每次15min。

     

           1%的鋨酸溶液固定樣品1-2h。小心取出鋨酸廢液,用0.1M,pH7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次,每次15min;

     

    2.2.脫水

     

           用梯度濃度(包括30%,50%,70%,80%,90%95%五種濃度)的乙醇溶液對樣品進行脫水處理,每種濃度處理15min,再用100%的乙醇處理20min;最后過度到純丙酮處理20min。

     

    2.3滲透

     

           用包埋劑與丙酮的混合液(V/V=1/1)處理樣品1h:用包埋劑與丙酮的混合液(V/V=3/1)處理樣品3h;純包埋劑處理樣品過夜。

     

    2.4包埋和聚合

     

    將經過滲透處理的樣品包埋起來,70℃加熱過夜,即得到包埋好的樣品。

     

    2.5切片和染色

     

    包埋塊在超薄切片機中切片,獲得100nm的切片,切片經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5-10min,即可在透射電鏡中觀察。


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